凍融工藝在mRNA疫苗中應用

   信使RNA（mRNA）是一類新興的生物治療藥物。雖然它們有相當大的前景，但這一領域仍處于起步階段。mRNA治療為挑戰(zhàn)性疾病的靶向治療和靈活生產提供了新的機遇，抗C O V I D - 1 9的mRNA疫苗的快速發(fā)展就證明了這一點。

   mRNA的臨床潛力已經超出了疫苗的范疇，擴展到其他先進的治療方法，例如蛋白質替代、基因治療和癌癥免疫治療。

   由于mRNA是脆弱的，不穩(wěn)定的，開發(fā) mRNA 疫苗的最重要的挑戰(zhàn)仍然是其固有的不穩(wěn)定性，因為它很有可能在冰點以上分解。

   mRNA 構建模塊的修飾以及能夠相對安全地包裹它顆粒的開發(fā)幫助了mRNA 疫苗候選者。但是這種新型疫苗仍然需要冷凍條件存儲、運輸和管理。

WHO世界衛(wèi)生組織在對mRNA在凍融方面的建議 ：

Specific attention should be given to minimizing the degradation of the mRNA during encapsulation with the LNPs and under manufacturing conditions known to influence the stability of the LNPs and final mRNA-LNP vaccine product (for example, the impact of thawing of the mRNA and the freezing rate of the LNPs or mRNA LNPs).

在用 脂質納米粒 包封期間以及生產條件下應特別注意盡量減少 mRNA 的降解，這個包封和生產添加會影響脂質納米粒及最終 mRNA-LNP 疫苗產品的穩(wěn)定性，例如：產生的影響條件包括mRNA解凍和LNPs或mRNA-LNPs的冷凍速率。

（WHO：Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations

已上市的某mRNA產品中在研發(fā)到生產中的凍融應用

Assessment report---C O V I D - 1 9 Vaccine（根據(jù)某上市的mRNA疫苗的評估報告---EMA）

Characterisation 特征  

The applicant provided a detailed characterisation of the mRNA active substance including detailed information on the structural properties of the mRNA CX-024414. Additionally, data on the chromatographic profile, the thermal denaturation as well as freeze thaw degradation and their influence on protein expression have been provided.

申請人提供了mRNA活性物質的詳細特征，包括mRNA CX-024414結構特性的詳細信息。此外，還提供了色譜圖、熱變性和凍融降解及其對蛋白質表達的影響數(shù)據(jù)。

評：該公司提供了向監(jiān)管機構提供了凍融降解的數(shù)據(jù)，以及凍融對蛋白表達的影響數(shù)據(jù)

The composition of the finished product

最終產品的成分Sucrose is added to promote product stability through freeze/thaw and long-term storage.

添加蔗糖是為了通過冷凍/解凍和長期儲存來提高產品的穩(wěn)定性。

評：該公司-采用蔗糖來提高凍融和存儲穩(wěn)定性

Manufacturing process development

生產工藝開發(fā)

mRNA-loaded LNP intermediate  載有 mRNA 的 LNP 中間體

The product consists of an mRNA-lipid complex dispersion that contains the mRNA (CX-024414) that encodes for the pre-fusion stabilised Spike protein of 2019-novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Comprehensive development data have been provided. Changes made during development have been described. They included scale-up, addition of a bulk freezing step, change of some equipment and revision of the lipid molar ratios to allow for harmonisation with the platform process.

該產品由一種mRNA-脂質復合分散體組成，其中包含編碼2019年XIN XING冠狀病毒（SARS-CoV-2）融合前穩(wěn)定 Spike 蛋白的mRNA（CX-024414）。已提供全面的開發(fā)數(shù)據(jù)。已經描述了在開發(fā)過程中所做的變更。它們包括放大、增加批量冷凍步驟、改變一些設備和修改脂質摩爾比以與平臺工藝匹配。

評：---在生產工藝開發(fā)過程中增加了大體積冷凍步驟。

Manufacture of the product and process controls

產品生產和工藝控制---涵蓋了冷凍工藝

The LNP manufacturing process comprises lipid stock solution (LSS) preparation, nanoprecipitation mixing, tangential flow filtration (TFF), dilution and cryoprotectant addition, clarification, fill, and freezing and storage.

LNP 制造過程包括脂質儲備溶液 (LSS) 制備、納米沉淀混合、切向流過濾 (TFF)、稀釋和冷凍保護劑添加、澄清、填充以及冷凍和儲存。

評：---在生產產品過程中冷凍和存儲是分開的。產品經冷凍后存儲。工藝步驟必須關注批次間和批次內的均一性，冷凍速率是關鍵參數(shù)。

Stability of the product

產品的穩(wěn)定性

mRNA-loaded LNP intermediate載有 mRNA 的 LNP 中間體

Stability studies in support of mRNA-loaded LNP intermediate freeze-thaw cycling were performed using the development lot. The results show that the mRNA-1273 LNP biophysical attributes (particle size, polydispersity, encapsulation) are not impacted by the different freeze-thaw processes (room temperature or 2°C to 8°C) or 5 cycles of freeze-thaw

使用開發(fā)批次進行了支持負載 mRNA 的 LNP 中間凍融循環(huán)的穩(wěn)定性研究。結果表明，mRNA-1273 LNP 生物物理屬性（粒徑、多分散性、封裝）不受不同凍融過程（室溫或 2°C 至 8°C）或 5 個凍融循環(huán)的影響，還進行了支持成品凍融循環(huán)的穩(wěn)定性研究。凍融循環(huán)最多重復五次。所有結果都在規(guī)格范圍內，表明最終產品在重復凍融步驟方面相對穩(wěn)定，支持五個凍融循環(huán)。然而，批準的產品信息中不允許在上市時反復凍融小瓶。

評：--經優(yōu)化的凍融工藝在規(guī)格范圍內，該公司的公司對產品的穩(wěn)定性沒有影響

Design and conduct of clinical studies

臨床研究的設計和執(zhí)行---仍需要評估凍融的穩(wěn)定性，涵蓋運輸和存儲

The RT-PCR assay is acceptably validated and additional validation studies to evaluate stability of clinical samples at various temperatures and freeze/thawing cycles to cover shipping and storage conditions were provided.

RT-PCR 測定得到了可接受的驗證，并提供了額外的驗證研究，以評估臨床樣品在各種溫度和冷凍/解凍循環(huán)中的穩(wěn)定性，以涵蓋運輸和儲存條件。

評：在臨床解凍做的凍融穩(wěn)定性實驗，涵蓋運輸和存儲，為后期上市做準備

該公司的凍融工藝條件是什么?

該公司凍融工藝的開發(fā)過程中，和SUS做了緊密合作，SUS根據(jù)此公司的要求，開發(fā)相應的工藝配方。

1. 特殊要求的凍融曲線降低了對mRNA產品的影響，影響主要來源于以下三個方面：

The goal must be to reduce STRESSES DURING FREEZING

目標必須是在凍結過程中減少壓力  

Stress is coursed by:

壓力主要這幾方面

• CRYOCONCENTRATION冷凍濃縮

• PH SHIFT pH pH漂移

• PROTEIN INTERACTION WITH THE ICE SURFACE蛋BAI BING液界面的變性

2. mRNA Freezing experience

mRNA冷凍實驗 得到的工藝數(shù)據(jù)。

mRNA experienced companies are freezing as fast as possible, so with rates from + to -60° C in < 5hours

經驗豐富的mRNA公司會盡可能快地凍結mRNA（在< 5小時內從+到-60°C凍結）

SUS公司SUS專注于下游到灌裝之間的解決方案。一體解決方案的產品涵蓋袋子保護殼RoSS，分裝設備RoSS.Fill，凍融設備pFTU，RoSS.Ship運輸?shù)?/span>

SUS的產品特點：YI LIU的技術

RoSS保護殼的ZHUAN LI技術，WAN MEI保護了袋子的安全；

RoSS.Fill快速精確分裝，超高靈活性和安全性；

凍融設備大容量，超低溫，WAN MEI的凍融曲線；

RoSS.Ship 超長的保溫時間和超高安全的運輸方式。

現(xiàn)在RoSS.Fill分裝系統(tǒng)和凍融系統(tǒng)在全球已經超過200多個用戶。

研熠作為SUS在中國的合作伙伴，提供SUS產品的技術咨詢、產品銷售和技術服務等。